Реакции иммунитета



Сторінка11/18
Дата конвертації01.02.2021
Розмір208 Kb.
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   18
Иммуноферментный метод основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу, щелочную фосфатазу. Одним из распространенных вариантов таста ИФА является твердофазный метод «Сэндвич – метод»: вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемый биологический образец. Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н2О2) и хромогены. Фермент (пероксидаза) разлагает Н2О2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают фотометрически.

Этапы проведения ИФА:



  1. Инокуляция биоматериала и реактивов в лунки полистироловых планшетов микротест системы (на которых сорбированы Ат против определенного Аг и фермент).

  2. Термостатирование и встряхивание на шейкере для равномерного перемешивания реакционной смеси в лунках планшета.

  3. Промывка лунок планшета на вошере (автоматический промыватель планшетов) – для отмывки не связавшихся субстанций (Ат, конъюгата и др.).

  4. Добавление окрашенного субстрата (хромогена).

  5. Регистрация результата на ридере (спектрофотометре, фотоколориметре для определения оптической плотности исследуемого раствора в лунках планшета).

В последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемых моноклонов, т. е. культуры клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.

Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - люминисценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего излучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом.

Суть метода заключается в том, что локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген – антитело. Метод основан на использовании явления люминисценции для выявления реакции антиген – антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани. При этом антитела, связанны с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. Большое преимущество метода заключается в его простоте, высокой чувствительности, а так же в быстроте получения результатов. Метод был предложен в 1942 г. Кунсом. Специфический белок метят флюорохромами – это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10-6 – 10-9сек). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитологическом препарате.

Механизм реакции: происходит конъюгация белка с флюорохромом, которая является по своей сути химической реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в котором краситель присоединяется к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε – аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы.

Метод применяется в трёх основных модификациях:

1. При прямом методе (Кунс и Каплан) на препарат, содержащий искомый антиген, наносят специфическую люминисцентную сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают в люминисцентном микроскопе. Таким образом, реакция протекает одноэтапно.

2. При непрямом варианте РИФ (Уэллер и Кунс). Раствор немеченных антител наносят на срез (ткань различных органов животных, содержащих известные антигены), а затем выявляют их при помощи меченных флюорохромом антииммуноглобулиновых антител.

3. Непрямой метод с комплементом (Гольдвассер, Шепард). Этот вариант метода разработан для определения комплемент – связывающих антител. После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути одна молекула антител может вызывать связывание многих С3 – молекул на срезе; их выявляют, обрабатывая срез флюоресцентно меченными антителами анти-С3. Препараты изучают в люминисцентном микроскопе (ЛЮМАМ).

В современной медицинской практике с каждым годом возрастает роль лабораторной диагностики как основного инструмента постановки диагноза и мониторинга терапии. Одним из бурно развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ (ИХА) - метод одноэтапного быстрого качественного определения наличия антител к возбудителям заболеваний in-vitro в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА - метод сухой иммунохимии, стрип-тест, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.

Принцип действия ИХА с помощью полосок состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения. В ИХА- тестах используется три типа антител:

1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).

2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.

3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Принцип действия ИХА с помощью тест - кассет, состоит в том, что исследуемый образец абсорбируется поглощающим участком планшета. При наличии в анализируемом образце антител к возбудителю заболевания последние вступают в реакцию с протеином А, конъюгированным с частицами коллоидного золота, образуя окрашенный комплекс. Этот комплекс движется по мембране и связывается с рекомбинантным антигеном, иммобилизованным на мембране в тестовой зоне планшета, образуя полоску розово-фиолетового цвета на уровне маркировки Т (Test). Остальные компоненты образуют полоску розово-фиолетового цвета в тестовой зоне на уровне маркировки С (Control). Результаты реакции оцениваются визуально в течение 10 минут. В том случае, когда концентрация антител к возбудителю заболевания в анализируемом образце сыворотки крови равна пороговому уровню или превышает его, в тестовой зоне выявляются две полоски розово-фиолетового цвета на уровне маркировок Т и С.

Основными преимуществами использования иммунохроматографического анализа являются:


  • Простота и удобство - позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков

  • Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль

  • Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день

  • Анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ

  • Независимость - не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача

Высокочувствительным методом, основанном на сочетании электрофореза и ИФА (или РИА) является иммуноблоттинг (Вестерн-блонттинг) с помощью которого проводится идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченных антивидовых антител.


1. Иммуноблот с РИА. Антигены возбудителя (исследуемые антигены) сначала разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Полученные фракции переносят (блоттинг – от англ. blot – пятно) электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану, которая помещается в специальную камеру. Затем эти блоты обрабатывают специальными Ат к специфическому Аг, отмывают и добавляют радиоактивно меченный конъюгат для определения связавшихся с Аг Ат. Блоты помещают в кассету с рентгеновской пленкой и на проявленной пленке при положительной реакции видны полосы локализации Аг, связавшего меченные Ат.

2. Иммуноблот с ИФА. Фирмы выпускают коммерческие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации, отмывают от несвязавшихся Ат больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

При наличии в исследуемой сыворотке крови специфических антител к индивидуальным белкам возбудителя образуется видимый преципитат. Положительные реакции выглядят в виде ИФА – пятен, каждое из которых соответствует дискретной паре антиген – антитело. Единственное пятно позволяет усомниться в истиности результата.



Поділіться з Вашими друзьями:
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   18


База даних захищена авторським правом ©res.in.ua 2019
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка