«Морфологія і ультраструктура вірусів. Культивування вірусів (1-е заняття)»



Дата конвертації05.05.2020
Розмір0.96 Mb.
Практичне заняття № 16

Тема: «Морфологія і ультраструктура вірусів. Культивування вірусів

(1-е заняття) »

Актуальність теми:

Віруси є етіологічним чинником великої групи інфекційних захворювань, різноманітних за клінічними проявами та перебігом, які характеризуються високою контагіозністю та здатністю викликати епідемії та пандемії. На даний час вірусологія, ще нещодавно будучи вузькою дисципліною, є однією з медико-біологічних дисциплін, що інтенсивно розвиваються.

Важливість вірусології зумовлена, насамперед, провідною роллю вірусів в інфекційній патології людини. Їх питома вага зростає по мірі зниження захворюваності бактеріальними, грибковими та протозойними інфекціями на фоні обмеженості засобів специфічної хіміотерапії. По-друге, на моделях вірусів (як найбільш просто організованих форм життя) вирішують багато фундаментальних питань біології та молекулярної генетики (наприклад, вчення про інтрони, сплайсинг та онкогени). Одним з найбільших вкладів вірусології в сучасну науку вважають відкриття зворотної транскриптази, використання якої лежить в основі генної інженерії.

Знання даної теми є необхідним для розуміння патогенезу вірусних захворювань на клінічних кафедрах. В практичній роботі лікаря це є важливим для клініко-морфологічної диференційної діагностики вірусних і інших інфекційних захворювань. На занятті студентам надається можливість оволодіти методами культивування культур клітин, методом інфікування культур клітин вірусовмісним матеріалом, що є необхідним для формування у студентів уявлення про методи діагностики вірусних захворювань.



Конкретні цілі:

  • Трактувати морфологію і ультраструктуру вірусів.

  • Аналізувати особливості взаємодії вірусів з живими системами.

  • Аналізувати методи культивування вірусів в лабораторних умовах.

Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція)

Назви попередніх дисциплін

Отримані навики

Анатомія людини

Аналізувати інформацію про будову тіла людини, системи, що його складають, органи і тканини

Гістологія, цитологія, ембріологія

Інтерпретувати мікроскопічну та субмікроскопічну структуру клітин

Медична і біологічна фізика

Трактувати загальні фізичні та біофізичні закономірності, що лежать в основі біологічних процесів.

Медична біологія

Пояснювати на молекулярно-біологічному та клітинному рівні закономірності біологічних процесів

Медична хімія

Трактувати загальні фізико-хімічні закономірності, що лежать в основі процесів розвитку клітин

Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін

Визначення

Вірус

Неклітинна форма живих істот, яка характеризується малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом. Віруси існують у двох якісно різних формах: позаклітинній – віріон та внутрішньоклітинній – вірус.

Нуклеокапсид

Білковий футляр (капсид), що оточує одну молекулу нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), разом формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називають капсомерами.

Суперкапсид (пеплос)

Зовнішня оболонка складних вірусів, що містить ліпіди та пронизана вірусоспецифічними білками глікопротеїдами. Структурною субодиницею суперкапсидної оболонки є пепломер.

Продуктивна інфекція

Тип взаємодії вірусу і клітини, при якому вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Абортивний тип взаємодії вірусу з клітиною

Тип взаємодії вірусу і клітини, при якому цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються.

Інтегративний тип взаємодії вірусу з клітиною

Тип взаємодії вірусу і клітини, при якому з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси, а нуклеінова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий процес об’єднання вірусної нуклеїнової кислоти з хромосомою клітини-хазяїна має назву вірогенії.

Дефектні віруси

Віруси, що втратили в процесі репродукції частину свого геному. Їх поділяють на 4 групи: дефектні інтерферуючі частинки, інтегровані геноми, віруси-супутники та псевдовіріони.

Теоретичні питання до заняття:

  • Сучасне визначення вірусів, погляди на природу і походження вірусів. Місце вірусів у системі живого.

  • Історія відкриття і головні етапи розвитку вірусології. Внесок вітчизняних вчених.

  • Принципи класифікації вірусів. Основні властивості вірусів людини і тварин.

  • Морфологія і ультраструктура вірусів. Типи симетрії вірусів. Хімічний склад, функції складових частин вірусів.

  • Репродукція вірусів. Етапи та види взаємодії вірусів з чутливими клітинами.

  • Бактеріофаг, історія вивчення. Структура, класифікація фагів за морфологією. Методи якісного і кількісного визначення бактеріофагів. Практичне використання бактеріофагів.

  • Форми взаємодії бактеріофагів з бактеріальною клітиною. Вірулентні і помірні фаги. Характеристика продуктивної взаємодії. Лізогенія і фагова конверсія.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

  • Вивчити морфологічні та структурні особливості вірусів, їх взаємодію з клітинами.

  • Охарактеризувати методи культивування вірусів.

  • Дослідити клітинні культури, їх використання у вірусології, а також поживні середовища для вирощування клітин.

  • Здійснити інфікування клітинних культур вірусовмісним матеріалом. Методи підготовки матеріалу для вірусологічного дослідження.

Зміст теми:

На практичному занятті студенти знайомляться з методикою забору, обробки та транспортування матеріалу для вірусологічного дослідження, приготуванням матеріалу для інфікування живих систем; вивчають зразки живильних середовищ, розчинів та сироваток, що використовуються при роботі з клітинними культурами; вивчають на демонстраційних препаратах різні види культур клітин, які використовуються у вірусології; порівнюють методи культивування вірусів у різних чутливих системах (клітинних культурах, курячих ембріонах, чутливих лабораторних тваринах); проводять інфікування культури клітин вірусовмісним матеріалом, інфікування курячих ембріонів та лабораторних тварин. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.



Рекомендації для оформлення протоколу

Представники основних родин вірусів і тварин

Родина

Найважливіші представники

Будова,«+» або «-»

нитка нукл. к-ти

РНК-вмісні віруси

Пікорнавіруси

Ентеровіруси (віруси поліомієліту, Коксакі, ЕСНО, серотипів 68-71, гепатиту А), риновіруси, афтовіруси (віруси ящуру), кардіовірус

проста будова,

+ нитка


Каліцивіруси

Віруси гастроентериту (Норфолк)

проста будова,

+ нитка


Реовіруси

Реовіруси, ротавіруси, орбівіруси

проста будова,

2-ниткова



Ретровіруси

Вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), вірус Т-клітинного лейкозу, онковіруси

складна будова,

+ нитка


Тогавіруси

Альфавіруси, вірус краснухи

складна будова,

+ нитка


Флавівіруси

Віруси кліщового енцефаліту, японського енцефаліту, пропасниці Денге, жовтої пропасниці

складна будова,

+ нитка


Буньявіруси

Вірус кримської геморагічної пропасниці

складна будова,

- нитка


Аренавіруси

Вірус лімфоцитарного хоріоменінгіту (ЛХМ), хвороба Ласса

складна будова,

- нитка


Філовіруси

Віруси Магбург, Ебола

складна будова,

- нитка


Рабдовіруси

Віруси сказу, везикулярного стоматиту

складна будова,

- нитка


Коронавіруси

коронавіруси

складна будова,

+ нитка


Параміксовіруси

Віруси парагрипу людини (ВПГЛ), паротиту, кору, респіраторно-синтиціальний (РС) вірус

складна будова,

- нитка


Ортоміксовіруси

Віруси грипу

складна будова,

- нитка


ДНК-вмісні віруси

Аденовіруси

Аденовіруси

проста будова

Парвовіруси

Вірус В-19

проста будова

Герпесвіруси

Альфа-герпесвіруси (вірус простого герпесу 1 і 2 типів (ВПГ-1, ВПГ-2), вірус вітряної віспи, оперізуючого лишаю), бета-герпесвіруси (цитомегаловірус (ЦМВ)), гамма-герпесвіруси (віруси Епштейна-Барр (ВГЛ-4))

складна будова

Поксвіруси

Вірус натуральної віспи (ВНВ), вірус віспи корів (вісповакцини)

складна будова

Гепаднавіруси

Вірус гепатиту В (ВГВ)

складна будова

Основні методи культивування вірусів:

  1. зараження лабораторних тварин

  2. зараження курячих ембріонів

  3. зараження клітинних культур

Типи вірусної інфекції: проуктивний, абортивний, вірогенія

Етапи репродукції вірусу в чутливій клітині:


Адсорбція і проникнення вірусу в клітину (віропексис)



Роздягання вірусного геному (депротеїнізація)



Синтез ранніх вірусних і-РНК



Синтез ранніх вірусних білків



Реплікація вірусного геному



Синтез пізніх вірусних і-РНК



Синтез пізніх вірусних білків



Самозбірка вірусу



Вихід вірусів з клітини (брунькуванням або вибухом клітини)


Типи взаємодії фага з клітиною: продуктивний, абортивний, лізогенія

Фази взаємодії бактеріофага з бактеріальною клітиною:


Адсорбція фага на поверхню клітини



Ін'єкція фагової ДНК всередину клітини



Синтез ранніх фагових і-РНК



Синтез ранніх вірусних білків



Реплікація фагової ДНК



Синтез пізніх вірусних і-РНК



Синтез пізніх вірусних білків



Композиція фагу



Вихід бактеріофагів з клітини



Класифікація культур тканин і клітин, які застосовуються у вірусології

  1. Тканинні або органні культури

Тканини зародкового органу або його частини, які підтримуються in vitro і зберігають диференціацію клітин і їх функції

  1. Клітинні культури

Характеристики

Первинно-трипсинізовані культури клітин

Перещеплювані культури клітин

Диплоїдні

культури клітин

Морфологія клітин порівняно з вихідною тканиною

Не відрізняється

Відрізняється

Відрізняється

Набір хромосом

Диплоїдний

Гетероплоїдний

Диплоїдний

Тривалість життя

Обмежена 1-3 пасажами

Не обмежена кількістю пасажів

Обмежена

20-100 пасажами



Ріст в суспензії

Не можливий

Можливий

Не можливий

Ознаки малігнізації

Відсутні

Завжди є

Відсутні


Період генерації

3-7 днів

2/3-1 дні

1-15 днів

Контактне пригнічення при вирощуванні на склі

Є

Відсутнє

Є

Приклади

1. Культура клітин нирок мавп

2. Культура клітин фібробластів ембріона людини

3. Культура клітин фібробластів курячого ембріона


1.HeLa (з карциноми шийки матки)

2. KB (з карциноми ротової порожнини людини)

3.HЕp-2 (карцинома гортані людини)

4. Vero (з нирки зеленої мавпи)



Лінії клітин фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець


Класифікація поживних середовищ для культур клітин

Природні

Ферментативні гідролізати

Синтетичні

Середовище Ендерса: 85-90% коров'ячої амніотичної рідині; 5-10% коров'ячого ембріонального екстракту, 5% кінської сироватки

Амінопептид

Гемогідролізат

Гідролізат лактальбуміну


Збалансовані сольові розчини: розчин Ерла, розчин Хенкса, розчин Дульбекко і Фогта

Підтримуючі середовища:

середовище 199, середовище Ігла, ДМЕМ (середовище Ігла, модифікована Дульбекко), МЕМ (середовище Мельника-Ігла)



Середовища для культури клітин, що застосовують в вірусології, поділяють на 2 основні категорії – ростові та підтримуючі.

Ростові середовища (РС) завдяки високому вмісту сироватки, сприяють швидкому клітинному росту. Після формування моношару та перед інокуляцією вірусу ростове середовище видаляють та замінюють підтримуючим середовищем. Для приготування ростового середовища до поживного середовища (наприклад, ДМЕМ), додають 5-10% сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) або ембріональної телячої сироватки (ЕТС) і антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин).

Підтримуючі середовища (ПС) з низьким вмістом сироватки дозволяють зберегти культури клітин в стані повільного стійкого метаболізму в період розмноження вірусу.

Завдання №1. На демонстраційних препаратах ознайомитись з різними розчинами, поживними середовищами та сироватками, які використовуються у вірусології.

Середовище 199

Включає понад 60 компонентів, в тому числі: повний набір амінокислот, 16 вітамінів, коферментів, азотисті основи, мінеральні солі, глюкозу та інші компоненти.

Середовище Ігла

Містить 13 амінокислот, 8 вітамінів. Мінеральні солі, глюкозу

Середовище Ігла DМЕМ (подвійне)

Містить амінокислоти, вітаміни. Мінеральні солі, глюкозу та інші компоненти. Використовують для культивування вимогливих до поживних речовин клітин

Гідролізат лактальбуміну 0,5%

Природне поживне середовище, яке містить продукти ферментації лактальбуміну і стимулятори росту

Примітка

Середовище 199, Ігла, гідролізат лактальбуміну готуються на збалансованих сольових розчинах. Названі середовища можуть бути використані як ростові середовища (РС) та як підтримуючі середовища (ПС). Для одержання РС необхідно додати антибіотики (до концентрації 100 ОД пеніциліну та 100 мкг стрептоміцину в 1 мл) та 5-15 % сироватки крові, що забезпечує ріст та розмноження клітин та запобігає бактеріальній контамінації. Для отримання ПС додають антибіотики та не більше 2 % сироватки крові, що забезпечує лише виживання клітин в сформованому моношарі.

Розчин Хенкса, Ерла (збалансовані сольові розчини)

Мають певний хімічний склад, рН, буферність, ізотонічність, містять глюкозу. Вони використовуються при виготовленні поживних середовищ, промиванні культур клітин та при створенні спеціального поживного покриття для виявлення бляшок на моношарі клітин.

Розчин Версену 0,02 %

Використовують для знімання клітин зі скла. Версен – це комплексон, який зв’язує йони двохвалентних катіонів (Mg++), які забезпечують зв'язок клітини між собою та склом.

Розчин трипсину 0,25 %

Застосовують для роз’єднання тканини на окремі клітини при виготовленні первинно-трипсинізованих культур та для знімання клітин зі скла.

Розчин натрію гідрокарбонату 7,5%

Використовують для встановлення рН в живильних середовищах та сольових розчинах.

Сироватка крові великої рогатої худоби (новонароджених телят, ембріональна сироватка)

Використовують без консервантів як джерело білку та факторів росту під час приготування середовищ росту та підтримки.

Завдання №2. На демонстраційних препаратах ознайомитись з різними видами моношарових клітинних культур, які використовуються у вірусології, замалювати в протокол.

Овал 1Овал 3Овал 2

Первинні Перещеплювані Диплоїдні

Питання для самоконтролю


  • Які ознаки покладені в основу сучасної класифікації вірусів?

  • Властивістю усього живого є здатність до самовідтворення. Для вірусів існує один тип розмноження. Як він називається? У чому його суть?

  • Які особливості репродукції РНК- та ДНК – геномних вірусів? В чому полягає роль зворотної транскриптази при репродукції ретровірусів?

  • Віруси є досить стійкими в довкіллі, до дії стерилізуючих та дезинфікуючих факторів та засобів. Які особливості структури вірусів зумовлюють цю властивість і сприяють розвитку вірусних епідемій та пандемій?

  • Первинною моделлю для культивування вірусів були лабораторні тварини. Назвіть їх, вкажіть переваги та обмеження їх застосування.

  • Віруси відносно просто можна отримати у великій кількості одним з методів культивування. Про яку систему культивування вірусів йдеться? Чому її не можна вважати універсальною?

  • Віруси є особливими паразитами клітин людини, тварин і рослин. Як цю особливість вірусів було використано для культивування вірусів іn vitro?

  • Яка відмінність дії помірних та вірулентних бактеріофагів? Яке їх практичне використання?




Поділіться з Вашими друзьями:


База даних захищена авторським правом ©res.in.ua 2019
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка